膝骨关节炎是临床常见及高发病，往往以膝关节疼痛、肿胀、变形及功能障碍为表现，严重影响人民的身体健康^[1]。本病治疗目前以药物控制为主，中医学称本病为“痹症”“鹤膝风”，并且展示了治疗本病的独到优势^[2]，本文研究的“桃仁-红花”系中医传统名方身痛逐瘀汤君药，亦是主要治疗药物，通过网络药理学的研究和运用，对身痛逐瘀汤治疗膝骨关节炎的作用靶点和信号通路进行预测，以期指导下一步的基础实验研究。

1   资料与方法

1.1  桃仁-红花活性成分与靶点筛选

分别在TCMSP数据库^[3]、BATMAN数据库^[4]及ETCM数据库^[5]中检索桃仁、红花2味中药的有效成分，在TCMSP数据库中以口服生物利用度（Qral bioactivity，OB）≥30%和类药性（Drug likeness，DL）≥0.18筛选活性成分及其靶点，ETCM及BATMAN数据库以置信度分数＞0.8为筛选条件，利用Uniprot数据库对靶点名称进行标准化。再基于Uniprot数据库中高质量手工注释的数据集Swiss-Prot，对靶标蛋白进行注释，获取靶标蛋白对应的标准编码基因名。为保证下游数据分析的可靠性，不符合OB、DL及置信度分数筛选标准的、无对应靶点的化学成分皆从下游分析中剔除。

1.2   KOA疾病相关靶点的筛选

1.2.1  数据库检索

在GeneCards数据库^[6]、TTD数据库^[7]、OMIM数据库^[8]中，以“knee osteoarthritis”为关键词进行检索，获得KOA相关疾病基因，将疾病靶点代入Uniprot数据库规范基因名称，合并去除重复及无法规范的靶点。

1.2.2 “药物-活性成分-靶点”网络图的构建

将药物有效成分靶点与疾病靶点输入Venny 2.1中，取两者交集作为关键靶点，即桃仁-红花治疗KOA的潜在作用靶点，并绘制韦恩图。将关键靶点相关数据导入Cytoscape3.10.0软件，构“药物-活性成分-靶点”相互作用的综合网络图，通过该网络来桃仁-红花治疗KOA的核心活性成分及靶点机制。

1.2.3  蛋白相互作用网络及核心靶点获取

将桃仁-红花治疗KOA的关键靶点集合上传至STRING平台进行PPI分析，物种设置为智人（Homo Sapiens），要求最低互动分数大于0.9，删去网络中的游离节点，获得桃仁-红花治疗KOA的PPI网络。将PPI网络数据导入Cytoscape3.10.0进行可视化处理与分析核心靶点，计算PPI网络各节点的连接度（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality，BC）、紧密度中心性（Closeness Centrality，CC），并分别计算Degree、BC、CC的平均值，构建桃仁-红花与KOA的核心靶点网络。

1.2.4  KEGG及GO富集分析

通过Metascape平台对药效靶点进行基因本体GO功能富集分析与KEGG 通路富集分析，过滤条件为P≤0.01，并将数据导入微生信在线工具实现数据可视化，绘制气泡及条形图展示结果。

1.2.5  “药物-成分-共同靶点-通路-疾病”网络图的构建

将相关靶点数据导入Cytoscape3.10.0软件，构建“药物-活性成分-靶点-通路-疾病”相互作用的综合网络图，通过该网络来探究桃仁-红花治疗KOA的核心活性成分及潜在机制。

2   结果

2.1  靶点的筛选 

通过TCMSP数据库、ETCM数据库及BATMAN检索到桃仁、红花两味药，去重后共274种活性成分，查询到对应靶点蛋白，利用Uniprot 数据库，查询出靶点蛋白所对应的基因名称，选取已验证且物种来源为human的结果，对应靶点共999个中药靶点。以“Chronic obstructive pulmonary disease”为关键词，在 GeneCards、TTD、OMIM疾病靶点数据库中进行检索，其中GeneCards数据库2235个，TTD数据库2个，OMIM数据库30个，去重后获得KOA相关疾病靶点2259个。

2.2   “药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络图的构建

运用Venny2.1平台将桃仁-红花靶点与疾病膝关节炎靶点取交集，得到335个共同靶点，即桃仁-红花治疗KOA的关键靶点，同时绘制韦恩图，见图1。

图1．桃仁-红花与KOA交集靶点韦恩图

2.4  桃仁-红花治疗KOA的PPI网络及核心靶点预测

为深入研究桃仁-红花治疗KOA的作用机制，将筛选出的335个关键靶点导入至STRING平台，要求最低互动分数大于0.9，去除部分游离节点后，获得桃仁-红花作用于KOA的PPI网络，见图2，3。借助Cytoscape3.10.0进行可视化处理与分析核心靶点，包括257个节点，2046条边。根据其Degree平均值为阈值提取子网络，得到一组包括92个节点1222条边的关联密切的核心基因群组的PPI网络图，见图4。根据 Degree 值由高到低排列，TP53（抑癌基因）、SRC（酪氨酸激酶C）、STAT3(信号转导和转录激活因子3）、AKT1(蛋白激酶B)及PIK3CA（磷脂酰肌醇4 ,5-二磷酸 3-激酶）等蛋白互作频次高，靶点之间的相互作用较强，Degree值大，提示可能为桃仁-红花治疗KOA的潜在核心作用靶点，如表1。

表1 桃仁-红花关键靶点的拓扑参数

图2 交集靶点STRING图

图3 交集靶点PPI 网络

注：节点越大，颜色越深，表示度值越大，网络中越处于核心地位

图54 核心靶点PPI图

2.5 GO 功能富集分析和 KEGG 通路富集分析

将桃仁-红花与KOA的335个交集关键靶点导入Metascape数据库进行GO富集分析，以P＜0.01为筛选条件，得到GO条目3363个，其中生物学过程（Biological Process，BP）2857条、细胞组成（Cellular Component，CC）186条、分子功能（Molecular Function， MF）320条。选择富集程度前20个条目进行可视化气泡图并生成条形图，见图5。利用 Metascape数据库对交集关键靶点进行KEGG富集分析，以 P＜0.01为筛选条件，得到227条KEGG富集条目，将输出结果按log10（P）值升序排序得到前15条关键信号通路绘制富集分析气泡图可视化，如图6。

(a) GO富集分析气泡图

（b）GO富集分析条形图

图5 GO富集分析结果（BP、CC、MF前20条）

图6  335个交集靶点KEGG富集分析

2.6 “药物-成分-共同靶点-通路-疾病”网络图的构建

    经药物成分靶点及疾病通路靶点导入Cytoscape3.10.0进行可视化处理与分析得到一组包括1400个节点6895条边的网络图，如图7。

图7 桃仁-红花治疗KOA“ 成分－靶点－通路” 网络

3   讨论

通过对“药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络图分析可以得出桃仁-红花治疗KOA的关键靶点共335个，进一步对关联密切的核心基因群组进行归纳，筛选出TP53（抑癌基因）、SRC（酪氨酸激酶C）、STAT3(信号转导和转录激活因子3）、AKT1(蛋白激酶B)及PIK3CA（磷脂酰肌醇4 ,5-二磷酸 3-激酶）可能为桃仁-红花治疗KOA的潜在核心作用靶点。

通过KEGG 分析发现桃仁-红花药对可能通过癌症途径、癌症中蛋白多糖、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶 B（PI3K-Akt）信号通路、MAPK 信号通路等多种途径，对KOA起到治疗作用。

综上所述，桃仁-红花在网络药理学对KOA治疗中显示了其重要的治疗作用，但其具体过程还需要基础实验进行进行进一步讨论。

参考文献

[1]谭钰静,杨宇轩,戴煜等.临床治疗膝骨关节炎的研究进展[J].大众科技,2023,25(07):119-122+55.

[2]郑泽陆,张瀚文,梁栋等.川芎-牛膝药对治疗膝骨关节炎的网络药理学探究[J].世界中西医结合杂志,2021,16(05):890-896.

[3]Jinlong Ru; Peng Li; Jinan Wang,et al.TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminformatics. 2014 Apr 16;6（1）:13.

[4]Kong X, Liu C, Zhang Z, Cheng M et al.BATMAN-TCM 2.0: an enhanced integrative database for known and predicted interactions between traditional Chinese medicine ingredients and target proteins. Nucleic Acids Res.2023 Oct 30:gkad926. doi:10.1093/nar/gkad926. PMID:37904598. Endnote

[5]Xu HY, Zhang YQ, Liu ZM,et al.ETCM: an encyclopaedia of traditional Chinese medicine. Nucleic Acids Res. 2018 Oct 26. doi:10.1093/nar/gky987.

[6]Stelzer G, Rosen R, Plaschkes I,et al.The GeneCards Suite: From Gene Data Mining to Disease Genome Sequence Analyses (PMID:27322403; Citations:2,595）

[7] Y. Zhou, Y. T. Zhang, D. H. Zhao, et al.TTD: Therapeutic Target Database describing target druggability information. Nucleic Acids Research. doi:10.1093/nar/gkad751 2023.PubMed ID:37713619

[8]Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM®。 McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine,Johns Hopkins University (Baltimore, MD),{date}.World Wide Web URL: https://omim.org/

[15]HSIN K Y, GHOSH S, KITANO H. Combining machine learning systems and multiple docking simulation packages to improve  docking  prediction  reliability  for  network pharmacology[J].PLoS One,2013,8（12）: e83922.