Effect of grass tea extract on mouse gut microbes

YAN Zhen，Feng Chenlong，PENG Jiaxing，ZHANG Xinyi，WANG Boyao，LI Lijuan

Abstract: in this paper explores the influence of straw tea on mouse intestinal microorganisms, 40 mice randomly divided into four groups, for the control, experimental group, experimental b, experimental group c, the control group only two weeks for saline gastric treatment, the first week of saline gastric model group, the second week for peritoneal injection of cyclophosphamide, experiment a, b, c group the first week of forsythia leaf tea extract gastric infusion, the second week for peritoneal injection of cyclophosphamide, respectively after experiment that forsythia leaf tea extract has protective effect on immune low mice intestinal.

Key words: grass tea extract， Escherichia coli

0 引言

近几年，因为中药在治疗流感过程中发挥重要作用，例如在新冠期间使用连花清瘟可以有效缓解新冠病毒出现的症状，因此人们对中药又充满重视，所以开始不断了解中草药的药性和作用，有些中药药性平和，适合调理身体等。毛建草全草可作药用，可解热消炎、凉肝止血，主治胸脘胀满、消化不良、风湿头痛、喉痛咳嗽等。辛长砺、卢跃环等研究表明，毛建草具有明显的降血脂、扩张血管、改善微循环的功效，说明其对高血压和冠心病患者有积极的治疗效果，并对轻度降低胆固醇有功效^[1]。根据《全国中草药汇编》《内蒙古植物药志》《高原中草药治疗手册》和《内蒙古中草药》等书籍的记载，毛建草全草可作药用，可解热消炎、凉肝止血，主治胸脘胀满、消化不良、风湿头痛、喉痛咳嗽等。辛长砺、卢跃环等研究表明，毛建草具有明显的降血脂、扩张血管、改善微循环的功效，说明其对高血压和冠心病患者有积极的治疗效果，并对轻度降低胆固醇有功效。毛尖茶叶是一种较常见的茶叶，它的色、香、味、形均有独特个性，颜色鲜润、干净，不含杂质，香气高雅、清新，味道鲜爽、醇香、回甘。毛尖茶叶的营养物质含量丰富，具有软化血管、润肺解毒的功效。软化血管：毛尖茶叶含有的胡萝卜素具有增强血管壁弹性的作用，可软化血管，且能帮助清理血管中的胆固醇，可以起到调节血压、血脂的作用。润肺解毒：毛尖茶叶是一种能润肺解毒的健康茶饮，能帮助分解部分烟草中的毒素，减少尼古丁对人体肺部的伤害，较适合常吸烟的人群饮用。

中国山西省古交、娄烦、宁武和原平等地区的农民，将毛建草嫩叶经粗加工后制成“毛尖茶”。“毛尖茶”加工方法比较简单，一般家庭都能制作，且有效成分不易散失，所制茶品具有香醇、味浓等特点。所以，在当地经常可以见到农户在销售自行加工的毛建茶，还有一些厂家开发的品牌毛建茶在古交、原平、宁武等地销售。通过毛建草作用的研究，发现毛建草叶对小鼠肠道微生物有重要作用，例如茶及其功能成分可以通过调节肠道菌群，促进产SCFAs的微生物的生长繁殖，进而增加机体内的SCFAs含量，发挥相应的健康功能。茶叶及其功能成分可以通过调节与BAs代谢密切相关的微生物的生长繁殖，进而改变机体内的胆汁酸池，从而发挥降脂减肥功能。本次试验是为了探究毛建草茶叶提取物对小鼠肠道大肠杆菌的影响。

通过喂养不同剂量的毛建草茶叶提取物溶液，然后进行解剖,取肠道中粪便进行大肠杆菌培养，探究不同剂量浓度毛建草茶叶浓度对大肠杆菌活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

毛建草叶,40只雌性 6 周龄 ICR 小鼠,大肠杆菌培养基

1.2 方法

（1 ） 毛尖草茶叶 提 取 物

连翘叶以 1：10比例加蒸馏水文火煎煮 30min,纱布 过滤,滤渣再重复煎煮 2 次,合并 3 次滤液,于旋转蒸发 仪浓缩至浸膏， 临用前配置成毛尖草茶提取物溶液。

（2）动物分组及处理

将40只雌性 ICR 小鼠按体重相近原则随机分为四组，分别为对照组 (Control)、实验高浓度组(HFLT)、实验 中浓度组(MFLT)、实验低浓度组(LFLT)，其中对照组 采用生理盐水灌胃 3 周, 在第 19-21 天腹腔注射生理 盐水 ;HFLT、MFLT、LFLT 三 组分别进行不同浓度的毛尖草茶提取(800mg/kg、 400mg/kg、200mg/kg)灌胃 4 周

（3）样品采集与处理

于腹腔注射 6 h 后, 对所有实验小鼠进行称重并 记录, 对所有小鼠采用水合氯醛麻醉(10%,0.1mL/10g 体重), 然后对其进行眼眶采血法采血。

颈椎脱臼法处死小鼠，解剖后取出小鼠肠道中的粪便，将粪便保存至-80℃保存，用于大肠杆菌的提取培养。

（4）指标检测

1）大肠杆菌形态学判断

取出小鼠粪便，加入生理盐水进行稀释，将粪便培养于大肠杆菌专用培养基，进行培养。挑取菌落进行革兰氏染色观察形态。

2）大肠杆菌运动性

制作半固体培养基，分组在接种环挑取大肠杆菌进行穿刺实验，第二天观察大肠杆菌运动性。

3）大肠杆菌药敏性检测实验

制作液体培养基，分组进行大肠杆菌药敏实验，将培养基用接种环均匀接种大肠杆菌，把药敏片平铺在培养基上，观察大肠杆菌的抑菌圈。

4）大肠杆菌的计数

将大肠杆菌稀释在不同浓度的生理盐水中，将其接种在培养基上，观察并计数大肠杆菌的菌落数。

1.3 数据分析

试验所得数据均是以Mean±SEM 来进行表示,采用 Graphgrad 软件进行单因素方差分析检验 (one-way ANOVA),各组数据之间的釆值可以通过用 Turkey 法来 进行多重比较和检验。

2 结果测定

2.1 毛尖草茶叶提取物对小鼠临床症状及体重变化 的影响

实验过程中小鼠在未进行腹腔注射毛尖草茶叶前后食欲均正常、精神良好。

由上表可知,注射毛尖草茶叶提取物前,小鼠的体重无显著差异.小鼠体重随小鼠灌胃毛尖叶茶浓度的增加而降低,有一定的剂量反应关系,浓度越低体重跟对照组差别越小。

这些结果提示 :注射毛尖草茶叶提取物后对小鼠机体造成了一定损伤。

表 1  各组试验小鼠体重比较

2.2 大肠杆菌形态学观察

将保存的粪便解冻，用生理盐水进行浸润，对培养基进行高压灭菌。制备牛肉膏蛋白胨普通培养基，用接种针使用平板划线法进行接种，放入培养箱中24小时。随后挑取培养出的菌落接种至大肠杆菌专用培养基，24小时后进行大肠杆菌的观察。 将大肠杆菌样品放置在载玻片上，用镊子轻轻拨动，使样品均匀分布在载玻片上。用滴管吸取固定液，滴加在样品上，使样品充分浸泡在固定液中。用吸管吸取结晶紫溶液，滴加在涂片上，染色1分钟，用蒸馏水冲洗。用碘液进行媒染，滴加在样品上，静置1分钟后用蒸馏水进行冲洗。用吸管吸取乙醇溶液，滴加在涂片上，染色1分钟，用蒸馏水冲洗，最后红染2分钟，水洗后用吸水纸吸干，远离酒精灯火焰处烘干。使用显微镜观察大肠杆菌的染色情况。先找到一个清晰的视野，观察大肠杆菌的颜色、形态、大小等特征。根据革兰氏染色，判定为阴性杆菌，为大肠杆菌。

2.3 大肠杆菌的运动性

如图可见不同浓度大肠杆菌运动性

穿刺法是一种通过观察细菌在半固体培养基中的运动轨迹来研究其运动性的方法。其原理在于，半固体培养基能够提供足够的支持力使细菌在垂直方向上移动，而细菌的运动轨迹则可以在培养基表面清晰可见。制作大肠杆菌培养基，用接种针依次挑取不同浓度的大肠杆菌，使用穿刺法依次进行穿刺。大肠杆菌在穿刺线上的生长情况表明，它们具有一定的运动性。在穿刺线中心附近，大肠杆菌密度较高，这是因为大肠杆菌通过鞭毛运动，从中心向四周扩散。随着距离的增加，密度逐渐降低，说明大肠杆菌的运动能力受到一定的限制。实验结果表明大肠杆菌的运动性受到抑制，毛尖草茶叶浓度越高，运动直径越小，表明大肠杆菌的活性受到抑制，说明毛尖草茶叶会影响肠道中微生物的活性。

2.4 大肠杆菌的计数

浓度梯度法是一种常用的微生物计数方法，通过将待测样品稀释至不同浓度，然后将稀释液逐级接种到培养基上，根据大肠杆菌的生长情况，确定其在不同稀释度下的数量。该方法具有较高的灵敏度和准确性，适用于大肠杆菌等微生物的计数。

本实验将对大肠杆菌进行计数，我们将从传统的培养计数法计数这是一种通过培养基来培育大肠杆菌，并通过肉眼可见的菌落数来推算其数量的方法。将不同浓度的大肠杆菌用生理盐水稀释为1：100，1：1000，1：10000，三个浓度梯度。进行三组实验。制备大肠杆菌培养基，用接种环将稀释液均匀涂布在平板上，放入培养箱中培养。如图表所示，大肠杆菌菌落数随毛尖草茶叶浓度的升高而降低，表明大肠杆菌的活性受到抑制，说明毛尖草茶叶对大肠杆菌起到抑制作用。

2.4 大肠杆菌药敏实验

药敏实验是一种检测细菌对抗生素敏感性的实验方法。通过对大肠杆菌进行药敏实验，我们可以了解哪些抗生素能够有效抑制或杀灭这种细菌，哪些则效果不佳。这不仅有助于医生选择最佳治疗方案，还能减少不必要的药物使用，降低耐药性的发展速度。

  在实验过程中，制备大肠杆菌液体培养基，将大肠杆菌接种至液体后扩大培养，24小时后，用接种环将液体培养基均匀涂布至培养基上，把药敏片按顺序依次放在培养基上标红的1为开始依次为青霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素、头孢唑啉、多西环素观察细菌生长情况。若细菌无法在某培养基上生长，说明它对该抗生素敏感；反之，则表明产生了抗药性。实验结果显示，大肠杆菌对某些传统抗生素如青霉素和红霉素的抗性明显增强，未出现明显抑菌圈而对新型抗生素如头孢类和氨基糖苷类仍保持较高的敏感性。

3 讨论

茶叶中有丰富的茶多酚、生物碱、有机酸，在生物体各个系统都可以发生作用， 因此当毛尖草茶叶提取物作用于小鼠肠道时，会使小鼠肠道菌群活力增强，使其免疫能力提高，从而影响肠道消化功能，使小鼠提升消化食物能力，而连翘作为一种能够清热解毒、散结消肿的中药，可以对因为环磷酰胺造成免疫低下的小鼠肠 道有保护作用，使其肠道正常蠕动进行消化，而本实验中提前进行毛尖草提取物灌胃小鼠没有发生更严重的后果， 同时不同浓度的毛尖茶叶提取物对大肠杆菌的增强抑制的程度也不一样，浓度较低时其对大肠杆菌的抑制就越强，浓度较高时其对大肠杆菌抑制性减弱，同时在大肠杆菌灌胃后不止肠道会发生影响， 肠道组织也会出现不同程度的变化。

本实验过程中出现部分小鼠死亡现象，因为灌胃操作失误导致小鼠死亡，大肠杆菌作为小鼠肠道重要的微生物，在注射后小鼠会因其作用活性得到增强或减弱，毛尖草药性微寒，可以降血压、抗衰老、消除疲劳，在小鼠进行毛尖草茶叶灌胃后会使肠道菌群得到抑制或增强，但因为茶叶提取物的浓度不同所以其作用程度也不同，本实验说明当毛尖草茶叶提取物会影响肠道中大肠杆菌的活性，浓度越高抑制程度越高。

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